蛋白层析柱的基本原理是将一份蛋白质混合物分成很多小份，从而使某些组分中目标蛋白的浓度通过浓缩得以增大。虽然已经有很多昂贵和特殊的设备可用于柱层析，但实际上它只需要基本的设备即可。
蛋白层析柱可以依赖用泵将溶剂以固定流速打入填装好的层析柱的自动设备来完成或者依靠流动相的重力作用自己完成。自动系统或者重力柱系统均可与自动组分收集器连接使用。
蛋白层析柱的一般操作步骤如下：
装柱、上样、平衡、洗脱、收集、柱再生。
（1）样品的选择与预处理。
（2）装柱。将层析柱垂直固定，一般是先在柱内装入约1/3高度的水或缓冲液排走空气。要求柱子装的均匀，不分层，无气泡。
（3）平衡。用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使介质充分平衡，柱床稳定。
（4）上样（加样）。打开层析柱下端出口，使缓冲液流出至刚好达到柱面。沿柱壁缓慢加入样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到柱面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁。加样时应尽量减少柱面的搅动。
（5）洗脱与收集。打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。流速不宜过快且要稳定，洗脱液的成分也不应改变（凝胶溶胀程度），整个洗脱过程中始终保持一定的操作压，可以用水或缓冲液作洗脱液。
（6）再生与保存。用原始平衡液进行充分洗涤，即可重复使用。